Этапы ПЦР-диагностики и необходимое оборудование

Этапы ПЦР-диагностики и необходимое оборудование ПЦР (полимеразная цепная реакция) – современный метод молекулярной биологии, широко применимый в медицине, ветеринарии, генетике, криминалистике и пищевой промышленности. ПЦР-диагностика позволяет выявлять наличие различных заболеваний (инфекционных, наследственных, паразитных и других) у животных. В настоящее время ПЦР применяется для диагностики Covid19, в том числе и в ветеринарии. Полимеразная цепная реакция состоит из 3-х этапов:

– выделение нуклеиновой кислоты (НК далее), содержащей ДНК или РНК;
– смешение выделенной НК с праймером;
– амплификация (процесс копирования участков ДНК или РНК-сегментов).

Выделение нуклеиновой кислоты

НК можно выделить из любого вещества, состоящего из клеток растительного или животного происхождения, которые их содержат. Например, из крови, слюны, а также из зерна, мяса на наличие мутаций или продуктов переработки на примеси ГМО. Выделение НК может производиться автоматически или вручную.

Этапы ПЦР-диагностики и необходимое оборудование Ручное выделение НК. Для этого потребуются приборы пробоподготовки и расходные материалы: гомогенизатор (для твердых веществ), центрифуга от 13 400 об/мин, вортекс, твердотельный термостат, раствор для ручного выделения НК, аспиратор, комплект дозаторов и штативы, наконечники, салфетки для ПЦР, средство для обеззараживания, контейнеры для сброса наконечников, пинцет, перчатки. Процедура производится в ламинарном боксе, а все оборудование и материалы не должны покидать его зоны. При ручном выделении НК многое зависит от внимательности оператора, так как это кропотливая и время затратная работа. Чем чище оператор выделит НК (без примесей), тем более достоверный и точный результат получится на выходе. 80% успешно поставленного ПЦР – это чистое выделение исходной НК. Срок выделения, к примеру, 12-96 проб может занимать до 2-3-х часов (в зависимости от опытности оператора). Плюсом данной методики является низкая стоимость выделения.

Автоматическое выделение НК осуществляется с помощью станции для выделения НК и белков – закрытая система, которая использует собственные силы. При автоматическом выделении чистота полученной НК достигает 100%, такую чистоту ручной метод никогда не даст. Для работы станции требуется наконечники, адаптеры, колонки для выделение и собственно реагент для выделение НК. Станция герметично закрыта и не требует установки ламинарного бокса, при этом стоимость выделения повышается в среднем в 3 раза.

Этап смешения

Этап смешивания так же может проходить в ручном и автоматическом режимах.

Ручное смешивание происходит в отдельном ламинарном боксе, в котором всегда находятся приборы и расходные материалы, которые будут использоваться только для смешения выделенной НК и праймера тест-системы. В ламинарном боксе стоит отдельная центрифуга от 13 000 об/мин, вортекс, твердотельный термостат, комплект дозаторов со штативом, контейнеры для сброса, наконечники, салфетки для ПЦР, перчатки, штативы для пробирок.

Автоматическое смешивание производится на станциях, которые совмещают в себе выделение и смешивание. Они еще более дорогостоящие, однако ламинарный бокс не нужен. Полученные результаты идут сразу в амплификатор.

Амплификация

Этапы ПЦР-диагностики и необходимое оборудование В амплификатор (термоциклер) роторного (на пробирках 36/72/104, адаптер) или планшетного типа (на 48/96 стрипов/планшетов) закладываются полученные смеси и задается с управляющего компьютера нужный процесс амплификации. В инструкции к тест-системе прописано, как выставляется режим на каждом тест-наборе. В зависимости от времени проведения амплификации оператор свободен от 45 минут до нескольких часов. Можно следить за процессом амплификации в режиме реального времени, если у Вас стоит реалтаймовый амплификатор. По завершении амплификации Вы получите распечатку результатов, проводите анализ полученных данных согласно методике интерпретации результатов ПЦР и будете знать, есть или нет искомый вирус в пробах. После проведения амплификации все использованные материалы отправляются в утилизатор (отдельный прибор) или по договору вывозятся в спецмешках (для особо опасных материалов).

В лаборатории необходимо установить фармхолодильник и морозильник для хранения проб и тест-систем, стерилизатор или автоклав для инструментов, а также облучатель-рециркулятор (настенный или передвижной).