Обзор методов выявления сложных патогенов респираторных заболеваний крупного рогатого скота с помощью иммуногистохимии: новые тенденции и возможности

Комплекс респираторных заболеваний крупного рогатого скота (КРБ) – это многофакторный и многоэтиологический синдром, который приводит к значительным экономическим потерям при производстве мясного и молочного скота. Синдром вызывается бактериальными и вирусными патогенами и усугубляется факторами окружающей среды и окружения. КРБ может привести к снижению прироста массы тела, продуктивности и репродуктивной эффективности, а также к увеличению затрат, связанных с лечением, и изменению коэффициента конверсии корма. КРБ может быть вызван целым рядом вирусных патогенов, таких как аденовирус крупного рогатого скота, альфа-герпесвирус крупного рогатого скота, вирус ветряной оспы крупного рогатого скота, син. вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, коронавирус крупного рогатого скота (BoCoV; Бетакоронавирус1), вирус парагриппа крупного рогатого скота, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота и вирус гриппа D, а также бактериальные патогены, включая Histophilus somni, Mannheimia haemolytica, Mycoplasma bovis и Pasteurella multocida.

Клинические признаки и исходы КРБ зависят от типа вовлеченного фактора риска и требуют применения нескольких методов обнаружения, основанных на анализе возбудителя. Хотя обнаружение на основе нуклеиновых кислот и ИФА на антигены доступны по цене и масштабируемы, они не обеспечивают локализацию антигена и не указывают на тяжесть заболевания.

Комплекс респираторных заболеваний (болезней) крупного рогатого скота (далее КРБ) вызывается различными патогенами, а также факторами риска, связанными с окружающей средой и окружением в хозяйстве. КРБ является самым дорогостоящим заболеванием для откормочных площадок крупного рогатого скота во всем мире. Иммуногистохимия (далее ИГХ) является ценным инструментом для улучшения нашего понимания, учитывая ее специфичность, чувствительность, экономическую эффективность и способность предоставлять информацию о локализации антигена и иммунном ответе. Новые тенденции в области ИГХ включают использование мультиплексной ИГХ для выявления сопутствующих инфекций, использование цифровой визуализации и автоматизации, усовершенствованные системы обнаружения с использованием улучшенных флуоресцентных красителей и интеграцию ИГХ с пространственной транскриптомикой. В целом, определение биомаркеров для раннего выявления, использование высокопроизводительной ИГХ для крупномасштабных исследований, разработка стандартизированных протоколов и реагентов, а также интеграция ИГХ с другими технологиями – вот некоторые из возможностей повышения точности и применимости ИГХ. Здесь мы кратко описываем различные методы и протоколы, используемые в ИГХ, и подчеркиваем их текущую и потенциальную роль в исследованиях.

В 2012 году было опубликовано сравнение различных методов выявления этиологии КРБ. Иммуногистохимия (ИГХ) играет важную роль в качестве дополнительного метода выявления, облегчая распознавание этиологических антигенов в отличие от случайных. Кроме того, ИГХ позволяет количественно определить и локализовать антиген в пределах поражений в пространстве. Эти элементы имеют жизненно важное значение для эпидемиологического надзора в масштабах населения и разработки профилактических стратегий. Распределение и локализацию инфекционного агента в тканях можно наблюдать, комбинируя ИГХ с другими тестами, что добавляет новую информацию о масштабах и тяжести комплексно-респираторной болезни. Таким образом, мы суммируем здесь различные методы и протоколы, используемые в ИГХ, и подчеркиваем их текущую и потенциальную роль в диагностике КРБ в будущем.

Принципы и процедуры иммуногистохимии

ИГХ – это сложный многопараметрический метод, который сочетает в себе гистологию, иммунологию и химию для выявления и локализации специфических антигенов в ткани. Как правило, процесс ИГХ включает фиксацию ткани, извлечение антигена, добавление антигенспецифических антител, визуализацию с помощью микроскопии и интерпретацию. Говоря вкратце, образцы ткани фиксируются, разделяются на срезы и помещаются на предметные стекла, а затем обрабатываются для выявления антигена. Применяются первичные антитела, которые связываются со специфическим антигеном, а затем вторичные антитела с хромогенными или флуоресцентными метками. Срезы тканей исследуют под микроскопом (например, можно использовать микроскоп цифровой Levenhuk DTX 500 LCD) для визуализации сигнала. Для обеспечения чувствительности и специфичности анализа тесты ИГХ должны быть валидированы у исследуемых видов животных. ИГХ превратилась из базовой одноэтапной процедуры в более чувствительные многоступенчатые методы, такие как комплекс авидин-биотин, пероксидаза-антипероксидаза, биотин-стрептавидиновые методы и усиление сигнала тирамидом, что приводит к значительному усилению сигнала. Также, внедрение роботизированной автоматизации и передовых методов детектирования значительно улучшило анализ больших наборов образцов, повысив производительность, воспроизводимость и эффективность анализа.

Подготовка тканей

Подготовка ткани является одним из наиболее важных этапов для успешного проведения ИГХ-анализа, поскольку необходимо сохранить целостность и антигенность целевого белка. Этапы подготовки ткани включают фиксацию, дегидратацию, вложение, сечение и монтаж. В двух основных методах используются либо фиксированные в формалине, либо залитые в парафин, либо свежезамороженные ткани. Использование парафиновой ткани является наиболее практичным, учитывая ее относительную простоту и способность сохранять ультраструктуру ткани, а также возможность длительного архивного хранения. Однако длительный контакт с теплом может легко модифицировать белки в ткани, что приводит к изменению конформационных эпитопов, представляющих интерес, и, следовательно, маскирует антигены и затрудняет их обнаружение антителами. Напротив, свежезамороженная ткань, в результате образования кристаллов льда во время замораживания, может быть сложной при разделке и удалении. при установке на предметные стекла ультраструктура ткани может быть значительно изменена. Однако поскольку этот метод позволяет избежать термической обработки или воздействия формалина, нативная конформация белков сохраняется, позволяет обнаруживать антитела без последующего извлечения антигена. Обезвоживание, заливка в парафин, повышенная температура и фиксация на предметных стеклах для микроскопии – все это может привести к потере реактивности антигена. Поэтому крайне важно оптимизировать протоколы фиксации каждого типа ткани и интересующего антигена с учетом таких факторов, как требования к гистопатологии, стабильность антигена и потребности в хранении.

Извлечение антигена

Выбор метода извлечения антигена или эпитопа (ER) зависит от антигена-мишени, типа ткани и метода окрашивания. Существует две наиболее распространенными стратегиями, используемыми в ИГХ:

1. Термоиндуцированный поиск эпитопа (HIER). HIER использует высокие температуры; HIER является наиболее широко используемым методом неотложной помощи, поскольку он прост, эффективен и сохраняет ультраструктуру тканей; однако он не подходит для антигенов, содержащих лабильные эпитопы, которые могут разрушаться при нагревании. Этот показатель зависит от рН и ионной силы используемых растворов. Большинство антигенов могут быть восстановлены в диапазоне рН 8-9. Однако некоторые ядерные антигены усиливают окрашивание в условиях пониженного pH, что подчеркивает важность подбора извлечения антигена на основе свойств интересующего антигена для предотвращения деградации тканей или ложноотрицательных результатов.
2. Ферментативно-индуцированный (EIER). EIER требует тканеспецифичных процессов оптимизации для обеспечения минимального структурного повреждения ткани или эпитопа. В этом методе используются протеолитические ферменты, такие как трипсин, для денатурации и экспонирования антигенов.

Оптимальная стратегия извлечения зависит от типа антигена и ткани, и для определения наиболее подходящего метода часто используется подход с использованием набора тестов. Чтобы определить оптимальный метод для конкретного антигена в конкретной ткани, подход с использованием набора тестов предполагает последовательное применение нескольких методов к одной и той же ткани, которую разрезают и исследуют их под микроскопом. Этот подход может повысить чувствительность и специфичность анализа и используется в тех случаях, когда интересующий антиген трудно обнаружить с помощью одного метода извлечения эпитопа.

Обнаружение антигена с использованием специфических первичных антител

При использовании ИГХ для выявления антигенов необходимо избегать перекрестной реактивности с другими белками. Поэтому крайне важно выбрать первичные антитела с высокой специфичностью и сродством к интересующему антигену. Антитело также должно быть высокой чистоты с минимальной перекрестной реактивностью при сохранении совместимости с видами хозяев. При многофакторных заболеваниях, таких как респираторные болезни, в образце ткани могут быть генетически сходные патогены, а также комменсальные организмы. Таким образом, необходимо использовать хорошо охарактеризованные и валидированные антитела, которые являются оптимальными для предполагаемого применения, а также соответствующие средства контроля.

Усиление сигнала и визуализация

Специфичность и чувствительность анализа могут быть повышены за счет усиления сигнала, генерируемого при связывании антитела с антигеном, ферментами или другими молекулами, которые катализируют реакцию для получения измеримого сигнала.

1. В ИГХ обычно используются методы усиления сигнала, такие как комплекс авидин-биотин, пероксидаза-антипероксидаза, биотин-стрептавидиновые методы и усиление сигнала тирамидом, флуоресцентные ИГХ (F IHC), и наночастицы золота или серебра. Вторичные антитела, меченные золотыми или серебряными наночастицами, используются в основном для сканирующей электронной микроскопии ИГХ.
2. Метод пероксидаза-антипероксидаза (PAP) основан на использовании фермента пероксидазы для катализа образования окрашенного продукта из субстрата. Для повышения чувствительности и специфичности были предприняты попытки усовершенствовать методику PAP путем включения щелочной фосфатазы, что привело к двойному методу мечения с использованием как щелочной фосфатазы, так и щелочной фосфатазы и пероксидаза.
3. В методе с использованием комплекса авидин-биотин (ABC) молекулы ABC связываются как с биотинилированным вторичным антителом, так и друг с другом с помощью биотинилированного фермента, такого как пероксидаза хрена, что улучшает обнаружение антигена. Этот метод амплификации оказался более чувствительным и специфичным, чем метод PAP. В качестве альтернативы, стрептавидин может быть использован для определения антигенов. может быть использован для амплификации вместо авидина.
4. Флуоресцентная ИГХ (FIHC) использует флуоресцентно меченые антитела для обнаружения антигенов с более высокой чувствительностью и большим усилением сигнала по сравнению с традиционной хромогенной ИГХ. Этот метод основан на принципе флуоресценции, который генерирует яркий сигнал там, где присутствует антиген, и обеспечивает мультиплексирование.
5. Усиление сигнала тирамидом (TSA) использует молекулу тирамида, меченную репортерной молекулой, для связывания с белками в месте HRP и получения хорошо видимого сигнала. По сравнению с ABC, TSA обеспечивает чувствительное обнаружение антигенов и мультиплексирование.